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17/07/2006
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Impatto
occupazionale ed ambientale dei nanotubi di carbonio, analisi
della citotossicità su linee cellulari
RIASSUNTO
I nanotubi in carbonio sembrano potenzialmente in grado di poter rivestire
un ruolo importante nelle applicazioni in campo farmacologico,
tale prospettiva necessita di una approfondita conoscenza
dei loro possibili effetti tossici. Sono stati studiati nanotubi multiparete
(10-50 nm) su linee cellulari non evidenziando nessun
effetto sull’induzione di apoptosi o necrosi.
ABSTRACT
[Lack of direct cytotoxic effect of intracellular nanotubes] Nanotubes
have a great therapeutic potential due to their astounding physico-chemical
features, the possibility to be funtionalised for
ad hoc uses, and the specific interaction of nanotubes as such with
life molecules (DNA and proteins). These features recommend a
thorough toxicological study before widespread pharmaceutic use.
We provide evidence that culture cells with phagocytic potential
internalise multiwall nanotubes (10-50 nm average size). This
is not accompanied by cytotoxicity in terms of induction of apoptosis
or necrosis at the doses used (up to 125 µg/ml).
Introduzione
I nanotubi di carbonio, ultimi prodotti della nanotecnologia, grazie alle
loro eccellenti proprietà elettriche, fisiche e meccaniche, sono i candidati
ideali per una moltitudine di applicazioni (1), che spaziano dalle
interconnesioni nell’ambito della microelettronica, alla messa a punto di
minitransistor cento volte più piccoli di quelli attualmente utilizzati per i
microchip. Ciò implica che, con ogni probabilità, in un futuro prossimo i
nanotubi eserciteranno un profondo impatto sulla vita di ogni giorno. Dal
momento che queste sono essenzialmente molecole nuove, alle quali l’uomo non
è mai stato esposto finora, è necessario esaminare l’effetto che l’esposizione
ai nanotubi potrebbe esercitare sulla salute e sull’ambiente. La
preoccupazione circa un possibile effetto dannoso
dei nanotubi sulla salute è aumentata dal fatto che
è noto che i nanotubi reagiscono con importanti classi di molecole biologiche,
come il DNA (2), i peptidi (3) e anche con cellule intere, per esempio, i
nanotubi possono essere usati come supporto per la crescita di cellule in
coltura (4). Queste proprietà dei nanotubi hanno suggerito un possibile uso in
biotecnologia, per esempio, per
la veicolazione di composti in specifici distretti del corpo, o per l’immobilizzazione
di cellule per ulteriori trattamenti (5), o come biosensori dopo appropriata
miscelazione con materiali reagenti (6). Un ulteriore sviluppo molto
interessante in biotecnologia nasce dalla possibilità di "funzionalizzare"
i nanotubi mediante la preparazione
di materiali ibridi o compositi, dove i nanotubi sono
legati a differenti materiali di interesse biologico (7). Questo implica che è
importante conoscere quale
effetto potrebbero esercitare i nanotubi all’interno delle cellule, da un
punto di vista tossicologico così come biotecnologico. Nel caso di nuovi
materiali, l’approccio tossicologico deve tener conto della natura dei
materiali in studio. I nanotubi si classificano in piccoli nanotubi a parete
singola [single wall nanotubes, SWNT (8)] e nanotubi più spessi con pareti
multiple [multi wall nanotubes, MWNT (9)]. I nanotubi si aggregano a formare
strutture la cui dimensione (da nm a µm) è compatibile con l’ingresso in
corpi, organi e tessuti, e con l’interazione con la superficie esterna
delle cellule. La conoscenza
praticamente nulla dell’effetto dei nanotubi sulle
strutture cellulari, insieme con l’ampia diffusione che
si prevede per l’uso dei nanotubi negli anni a venire,
ci ha potato ad analizzare l’interazione nanotubicellule e
gli effetti che i nanotubi possono esercitare sulla vitalità
cellulare, dal momento che un possibile effetto dannoso
potrebbe richiedere particolari precauzioni atte a controllare
sia l’esposizione umana, sia il loro possibile uso
terapeutico. È noto che
cellule fortemente danneggiate muoiono passivamente
per necrosi, mentre cellule solo lievemente danneggiate
muoiono per apoptosi (10). Lo studio dell’interazione nanotubi-cellule
ci ha rilevato che i nanotubi entrano nelle
cellule e di per se non inducono né necrosi, né apoptosi.
Materiali e
Metodi
Le cellule U937 sono coltivate in incubatori standard (37
°C e 5% CO2) in RPMI 1640 al 10% di siero fetale bovino e
antibiotici. La vitalità cellulare è stata controllata con
il test di esclusione allo ioduro di propidio. Le cellule apoptotiche
sono state valutate mediante colorazione del nucleo
con il colorante specifico per il DNA Hoechst 33342,
che permette di rivelare la morfologia nucleare che facilmente
identifica le tipiche figure dei nuclei apoptotici. I
nanotubi di carbonio usati in questo lavoro sono nanotubi con
pareti multiple (MWNT), sintetizzati e trattati come
riportato in (11). Il diametro dei MWNTs è nell’intervallo di
10-50 nm e la lunghezza è di massimo 100 µm.
Risultati
Nanotubi di piccole dimensioni potrebbero teoricamente entrare
nelle cellule, grazie alla porzione idrofobica delle
molecole. Abbiamo verificato questa ipotesi studiando l’interazione
in vitro tra nanotubi e cellule umane. Abbiamo scelto
le U937 perché sono cellule tumorali umane di
origine monocitaria e quindi in grado di fagocitare particelle sia
organiche che inorganiche. Abbiamo esaminato, così,
la possibile entrata passiva dei nanotubi in cellule U937.
In particolare, abbiamo aggiunto concentrazioni crescenti
di MWNT (da 2,5, 25 e 125 µg/ml) alle U937 in terreno
di coltura completo e le abbiamo incubate per 72 ore.
L’analisi microscopica ci ha rilevato che i nanotubi entrano
nelle cellule U937 e non provocano alterazioni morfologiche,
né citoplasmatiche né nucleari. Inoltre,
si suppone che i nanotubi siano inerti, quindi non
ci si aspetta un effetto chimico diretto. Al contrario, la loro
capacità di legare molecole biologiche come ad esempio proteine,
lipidi o acidi nucleici, potrebbe influenzare il comportamento
di tali macromolecole; potrebbero quindi indurre
una risposta da stress. Per testare questa ipotesi abbiamo analizzato
la vitalità cellulare in seguito ad ingresso dei
nanotubi nelle cellule. In particolare abbiamo esaminato la
citotossicità dei nanotubi e l’eventuale capacità dei nanotubi
di indurre il meccanismo intrinseco di suicidio cellulare
per apoptosi. L’incubazione per 72 ore con i nanotubi non
induce un effetto citotossico diretto sulle U937, dal
momento che non abbiamo rilevato nessun aumento né di
apoptosi né di necrosi rispetto alle cellule non trattate.
Discussione
È noto che i nanotubi non sono essenzialmente tossici, e
interagiscono poco con la materia vivente. D’altro canto, è noto che i
nanotubi interagiscono con specifiche molecole cellulari, implicando così
multipli possibili usi in biotecnologia e
nella veicolazione di farmaci. Queste importanti possibili applicazioni ci hanno
spinto ad investigare l’interazione
nanotubi-cellule umane. È interessante notare che i nanotubi entrano
passivamente nelle cellule ma non hanno un effetto citotossico diretto. Dal
momento che i nanotubi sono in grado di legare molecole biologiche ci proponiamo
di investigare se possono alterare altri parametri cellulari come il metabolismo
ossidativo e lo stato degli
organelli intracellulari.
Richiesta
estratti: Prof. Antonio Bergamaschi, Servizio di Medicina del Lavoro,
Policlinico Universitario Tor Vergata, Viale Oxford 81, 00133 Roma, tel.
06.20902201, fax 06.20902212, e-mail antoniobergamaschi@tiscali.it
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3) Wang S, Humphreys ES, Chung SY, Delduco DF, Lustig SR, Wang H, Parker KN,
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11) Vittori Antisari M, Marazzi R, Krsmanovic R. Carbon 2003; 41: 2393-2401.
Realizzato con fondi MURST 2003.
Autori:
L. Ghibelli 1, M. De Nicola 1, G. Somma 2, C. Cerella 1, M. D’Alessio 1, E.
Romeo 2, A. Magrini 2, A. Bergamaschi 2
1 Dipartimento di Biologia, 2 Cattedra di Medicina del Lavoro, Università di
Roma Tor Vergata
Fonte: G Ital Med Lav Erg 2005; 27:3 291 - PI-ME, Pavia 2005
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